一、抗原修復(fù)不充分
原因：甲醛固定導(dǎo)致抗原表位交聯(lián)封閉，或修復(fù)液pH值錯誤、時間不足。
解決：
使用pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液（多數(shù)抗體適用）。
高壓修復(fù)（121℃, 2~3分鐘）優(yōu)于微波修復(fù)。
二、一抗問題
原因：濃度過低、孵育時間過短或抗體失效。
解決：
進行濃度梯度測試（如1:50~1:400）。
設(shè)立陽性對照驗證抗體活性。
三、組織固定不當
原因：固定時間過長（>48小時）或固定液濃度過高。
解決：
推薦10%中性福爾馬林固定6~24小時。
及時固定（大標本需切開）。
四、操作失誤
原因：組織干燥、切片過厚或試劑覆蓋不全。
解決：
保持切片濕潤，厚度控制在3~4μm。
使用DAKO筆圈畫組織防止液體流失。
五、DAB顯色異常
原因：顯色時間過長或DAB變質(zhì)。
解決：
現(xiàn)配現(xiàn)用DAB，顯色時間控制在1~5分鐘。
顯微鏡下監(jiān)控顯色過程。
六、其他因素
內(nèi)源性酶未阻斷：用3% H2O2處理10分鐘（室溫）。
脫鈣組織處理：改用EDTA脫鈣液避免抗原破壞。
若問題持續(xù)，建議檢查抗體特異性或重新取樣。
